Nutriaceutici per contrastare l’obesità
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD), ovvero l’accumulo eccessivo di lipidi nel fegato non associato all’abuso di alcolici, è attualmente la malattia epatica più comune nel mondo. Nei paesi occidentali, la prevalenza di NAFLD nella popolazione generale è del 20-30%. La NAFLD comprende un ampio gruppo di malattie del fegato, che va dal fegato grasso (steatosi epatica) alla NASH (steatoepatite non alcolica), fino alla cirrosi, lo stadio più avanzato della malattia epatica.
La steatoepatite non alcolica (NASH) è caratterizzata da rigonfiamento epatocellulare, infiammazione e stress ossidativo, che sono le principali cause della progressione della NAFLD. Queste modificazioni possono stimolare le cellule stellate del fegato causando la fibrosi. In fase avanzata, la steatoepatite non alcolica può provocare cirrosi e ipertensione portale.
Anche se è stato ampiamente dimostrato che la progressione della NAFLD è influenzata in modo negativo da scorretti stili di vita (elevato apporto calorico, sedentarietà), spesso i pazienti non cambiano i comportamenti non salutari o, comunque, impiegano molto tempo a farlo. Sfortunatamente, se non viene adottato un approccio adeguato, il danno epatico correlato alla NASH può progredire, portando alla cirrosi epatica ed anche a epatocarcinoma. In questo contesto, potrebbe essere importante identificare molecole antinfiammatorie e antiossidanti in grado di contrastare la progressione di questa malattia.
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS), sono generate all'interno delle cellule da attività metaboliche implicate nella risposta allo stress e nell'infiammazione. Un sistema di difesa antiossidante compromesso promuove l'accumulo di stress ossidativo inducendo danni ai tessuti e promuovendo uno stato pro-infiammatorio che porta alla secrezione di citochine infiammatorie, come: IL1-α, IL-6, IL-2, TNF-α e G -CSF.
Il metabolismo del grasso epatico dipende dall'attività mitocondriale e genera ATP ma anche specie reattive dell'ossigeno (ROS). Considerando il ruolo fondamentale dei mitocondri nel fornire energia, non sorprende che la loro funzione e comportamento siano cruciali per la fisiologia della salute cellulare e che la "disfunzione mitocondriale" sia stata implicata in una vasta gamma di malattie infiammatorie croniche e disturbi correlati come anche nella NAFLD. Le alterazioni mitocondriali influenzano negativamente l'equilibrio tra i sistemi antiossidanti e pro-ossidanti, inducendo l'accumulo di ROS e di conseguenza la progressione del danno epatico.
Le sirtuine sono una famiglia di deacetilasi NAD+ dipendenti che mediano importanti vie metaboliche e regolano meccanismi di risposta allo stress, tra cui anche lo stress ossidativo soprattutto durante la condizione di restrizione calorica. E’ stato dimostrato che, durante la progressione della NAFLD, due particolari sirtuine: la sirtuina 1 (SIRT1) e la sirtuina 3 (SIRT3) sono correlate a modificazioni metaboliche, segnali infiammatori e difesa contro lo stress ossidativo. Tuttavia, sebbene entrambe le sirtuine siano state associate alla progressione NAFLD / NASH, i loro ruoli specifici rimangono ancora non completamente definiti.
I fitochimici naturali come i polifenoli sono associati alla riduzione dello stress ossidativo e alla riduzione dell'infiammazione nelle malattie infiammatorie croniche. L'oleuropeina (ole), un composto polifenolico, è principalmente presente nelle foglie e nei frutti dell'olivo e ha effetti sia antiossidanti che antinfiammatori. Gli estratti di foglie di olivo hanno effetti terapeutici. L’Ole ha proprietà epato/cardioprotettive, antiossidanti, antinfiammatorie, antiipertensive e antitumorali.
Tuttavia, le proprietà antiossidanti dell’Ole sono ancora da chiarire, poiché mostrano meccanismi contrastanti. Infatti, nelle cellule tumorali tiroidee l’Ole è in grado di inibire la proliferazione cellulare riducendo i livelli di ROS, mentre nelle cellule tumorali prostatiche mostra effetti pro-ossidanti. Inoltre, mostra comportamenti opposti in condizioni normali rispetto alle cellule tumorali. È interessante notare che l'idrossitirosolo, un metabolita dell’Ole, ha nella sua struttura un anello aromatico, che è una caratteristica comune degli estrogeni. In accordo con tale aspetto, il suddetto composto fenolico ha effetti specifici di genere, probabilmente a livello del legame con il recettore degli estrogeni (ER).
Secondo dati di letteratura, è evidente che sono necessari ulteriori studi per determinare l'esatto meccanismo con cui l’Ole esercita i suoi effetti antiossidanti.
Ci siamo chiesti se, in presenza di steatosi epatica, il miglioramento del danno epatico correlato all’assunzione di oleuropeina potesse essere associato ad un aumento delle difese antiossidanti, valutando l'attività degli enzimi della famiglia SOD e della catalasi (CAT).
Alcuni dei dati riportati di seguito sono oggetto di un lavoro in fase di pubblicazione sulla rivista Journal of Functional Food.
Per valutare le proprietà di riduzione dello stress ossidativo dell’Ole, abbiamo studiato i suoi effetti sull'attività di alcuni principali enzimi antiossidanti, la Superossido Dismutasi 1 e 2 e la catalasi, in topi C57BL/6J alimentati con Normal Diet o High Fat Diet per 8 settimane, aggiungendo o meno, alla loro dieta lo 0,03% di Ole per le successive 8 settimane.
Tramite dosaggi enzimatici spettrofotometrici abbiamo osservato che l’attività della SOD1 è rimasta invariata nei topi ND e HFD, prima e dopo il trattamento con Ole; mediante analisi immunoistochimiche, abbiamo osservato che nei topi HFD la SOD1, prevalentemente presente nel nucleo, è parzialmente traslocata nel citosol in seguito a trattamento con Ole.
La localizzazione nucleare di SOD1 è probabilmente correlata alla maggiore produzione intracellulare di ROS dopo la somministrazione della dieta ad alto contenuto di grassi, e può essere interpretata come un tentativo della cellula di mantenere la stabilità genomica.
La localizzazione intra-nucleare di SOD1 è in grado di indurre l'attivazione di fattori di trascrizione nucleare, come PGC1, ATM e Mec1 che a loro volta stimolano l'espressione di geni antiossidanti. Di conseguenza, la somministrazione di Ole, esercitando effetti antiossidanti, consente a SOD1 di rientrare nel citoplasma riducendo lo stress ossidativo intracellulare.
Sorprendentemente, abbiamo osservato un aumento dell’espressione e dell’attività enzimatica specifica della SOD 2, la forma mitocondriale, solo nei topi femmina nutriti con l’HFD, dimostrando un diverso comportamento legato al genere di tale enzima.
Inoltre, abbiamo osservato la stessa induzione specifica Ole-dipendente nell'espressione della proteina SIRT3 nei topi femmina HFD. L'espressione proteica alterata di SIRT3 è stata associata all'assunzione di una dieta non salutare ed è stato ipotizzato che abbia un ruolo principale nell'inizio del danno epatico in seguito a steatosi. È interessante notare che l’andamento simile dell'attività di SOD2 e dell'espressione della proteina SIRT3 sembra riflettere un'attivazione più efficace delle difese antiossidanti da parte delle femmine rispetto ai topi maschi. Inoltre, è stato dimostrato che SIRT1 in risposta allo stress cellulare, è in grado di deacetilare il fattore di trascrizione FOXO1 che, a sua volta, aumenta l'espressione di un numero enorme di proteine coinvolte nella resistenza allo stress, inclusa la SOD2.
E’importante sottolineare che la buona efficienza del sistema di difesa antiossidante dipende dalla cooperazione dell'attività degli enzimi antiossidanti. Pertanto, abbiamo valutato anche il rapporto CAT/tSOD tra l’attività enzimatica della catalasi e quella delle SOD totali, tale rapporto è un indicatore migliore dell'efficacia di scavenging contro le ROS, rispetto alla valutazione dell'attività dei singoli enzimi antiossidanti.
In un modo molto singolare, l’HFD ha indotto un comportamento opposto tra maschi e femmine. Infatti, mentre il sistema di difesa antiossidante ha cercato di rispondere allo stress indotto da HFD nei topi femmina, nei maschi è stata osservata una diminuzione delle difese enzimatiche antiossidanti. Mentre, l’assunzione di Ole ha avuto come effetto un aumento significativo del rapporto CAT/SOD nel fegato di topi HFD sia maschi che femmine, ripristinando le differenze di risposta all’HFD legate al sesso.
Il nostro lavoro ha dimostrato che l’Ole, in presenza di HFD, è stata in grado di invertire completamente le differenze sessuali specifiche correlate all'HFD, suggerendo che l’oleuropeina, in condizioni di stress, ha un significativo effetto antiossidante, rendendo la catalasi in grado di limitare il danno epatico indotto dai radicali liberi anche nei maschi.
Infine, tutti i dati sopra riportati sono stati confermati dalla valutazione dei livelli di danno da stress ossidativo, mediante il dosaggio della Malondialdeide (MDA), marker della perossidazione lipidica.
L'HFD, come previsto, ha indotto un aumento del danno epatico correlato allo stress ossidativo nei topi sia maschi che femmine, tuttavia l’Ole non solo è stata in grado di proteggere il fegato dallo stress ossidativo in entrambi i sessi, ma ha persino riportato il danno ossidativo epatico a livelli più bassi della condizione basale.
Ancora una volta, il livello di danno ossidativo era più basso nelle femmine HFD, ipotizzando la presenza di una maggiore resistenza basale al danno ossidativo nelle femmine.
Il nostro lavoro ha dimostrato che l’Ole ha un'attività specifica legata al sesso. L’Ole, infatti, ha ridotto in modo specifico la quantità epatica di MDA, aumentando la segnalazione SIRT3/SOD2, coinvolta nella riparazione ossidativa mitocondriale, nelle femmine ND ma non nei topi maschi.
Il nostro lavoro dimostra che il trattamento con Ole è in grado di ripristinare, nei topi nutriti con HFD, lo squilibrio dei tre enzimi antiossidanti studiati, migliorando il danno correlato allo stress ossidativo del fegato che caratterizza la progressione della NAFLD verso la NASH. È interessante notare che il trattamento con Ole ignora le differenze specifiche del sesso, ripristinando un'efficace risposta antiossidante in entrambi i sessi in presenza di stimoli stressanti come una dieta ad alto contenuto lipidico.